祿米教您怎么操作實驗室無菌環境怎樣監控和檢測？

【導讀】 微生物檢測人員天天都需要在無菌室工作，在超凈臺或者生物安全柜里操作，為了保證我們檢測的準確性，我們必須要求無菌室以及工作臺符合要求，那我們應該怎樣進行驗證呢？下面我們介紹一下環境中無菌或殺菌效果應如何檢查。


微生物檢測人員天天都需要在無菌室工作，在超凈臺或者生物安全柜里操作，為了保證我們檢測的準確性，我們必須要求無菌室以及工作臺符合要求，那我們應該怎樣進行驗證呢？下面我們介紹一下環境中無菌或殺菌效果應如何檢查。



一、紫外燈殺菌效果檢查
紫外燈在使用過程中輻射強度會逐漸降低，影響其殺菌效果，故應該定期檢查。紫外燈的殺菌有效波長是253.7nm，其強度可以用中心波長254nm的紫外線強度計測定。在沒有紫外線強度計的情況下可以采用生物學替代。
生物學測試簡要步驟如下：選用枯草芽孢桿菌ATCC 9372，制成106CFU/mL~108CFU/mL濃度的菌懸液；選用經脫脂處理的0.5cm×1.0cm大小的布片或鋁片，高壓滅菌后用作載體；每個載體上滴一滴制備好的菌懸液，干燥后備用；將8個染菌載體放于無菌器皿中，置于紫外燈下1m~1.5m處，開啟紫外燈照射，于0.5h、1h、1.5h和2h各取出2個染菌載體，分別投入盛有5mL緩沖蛋白胨水的洗脫液；系列稀釋后進行平板計數；同法取8個染菌載體用做陽性對照，操作除不經紫外此昂照射外與試驗組相同。

殺滅率=（陽性對照回收菌數-試驗組回收菌數）/陽性對照回收菌數×100%
殺滅率大于99.9%時，認為紫外燈殺菌效果合格。

二、無菌室空氣質量檢查
無菌室空氣質量檢查應按照采樣計劃，根據情況對處于空態、靜態和正常運行的風險區，使用適當的儀器采集空氣中微生物，測定并監控風險區空氣的微生物污染。空氣懸浮微生物的采樣和計數方法多種多樣，根據多需采樣目的決定具體的采樣方法和采樣器。因采樣器的采集效率不同，應慎重選擇合適的方法和設備。采樣器分為兩類：被動式采樣器，如落菌盤；主動式采樣器，如過濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。

1.沉降法
落菌盤等被動式空氣微生物采樣器不能測量空氣中的微生物的總數，而是測量空氣中微生物在表面的沉降率。只要確定單位時間落菌盤上微生物的數量，再根據落菌盤的暴露面積與暴露時間之間的關系，即可大致計算出空氣中微生物的數量。
面積小于30m2的室內設一條對角線取3點，在其中心以及兩端距墻1m處各取1點；面積大于30m2的室內房間四面距墻1m和中央各放置一個平皿，高度為實驗臺高度。培養基平皿開蓋暴露10min，然后蓋上蓋子倒放，培養48h，計數每個平皿上的菌落數。
日常監控時，可以設定可接受的菌落數限值。一般無菌室所有的取樣平皿上的細菌總數應小于15個�？諝赓|量良好的無菌室，通常么個平皿上生長的細菌不超過2個。

2.空氣過濾法：
空氣采樣除了自然沉降法外，還可以使用專門的主動式采樣器。主動式采樣器可以評估風險區空氣微生物的特征。主動式采樣器主要包括過濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。
撞擊采樣器可以分為狹縫式采樣器、離心式采樣器和針孔式采樣器。狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣，通過采樣器的縫隙式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉的平板培養基表面上，附著的活微生物粒子經過培養后形成菌落，予以計數。離心式采樣器由于內部風機的高速旋轉，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心機的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時間撞擊到專用的固形培養條上，經培養后形成菌落，予以計數。
過濾式空氣采樣器是*常用、*簡單的空氣采樣器。過濾式采樣器有采樣頭、濾器、流量計和抽氣泵組成。過濾式采樣器的結構如圖：


開動電機后，抽氣泵工作，帶動空氣吸入采樣頭，空氣通過濾器的時候，大于濾膜孔徑的顆粒被阻留，當達到預先設定吸氣體積后抽氣泵停止工作，將濾膜取出轉貼到培養基上，培養后計算空氣中微生物的濃度。過濾式采樣器捕獲效率高，但是濾膜材料可能影響微生物的存活率，還有采樣阻力大、流量易變的缺陷。
在沒有空氣采樣器的情況下，可以自己組裝如下圖的空氣錯率采樣裝置，注意組裝連接處必須密不透風。


打開圖中大瓶的龍頭，空氣就被抽入無菌水中。待4L水流完，就有4L空氣通過小瓶中的無菌水，也就是4L空氣中的微生物被留存在50mL無菌水中。無菌吸取1mL過濾的水樣進行平板計數，做2個平行。37℃培養48h計數。
每升空氣中的細菌數為：2個平皿上細菌數量的平均值×50/4。

三、無菌室物體表面微生物污染檢查
表面微生物污染的檢查需要使用接觸器或拭子，獲得某表面某時間點的微生物數量。
接觸器以容器內已知面積的固態培養介質與表面接觸，接觸面積應大于20cm2，均勻用力將整個營養介質壓住表面幾秒鐘，不得移動。然后將裝置放回容器內，再清潔采樣表面，清除殘留營養物。接觸器培養后顯現的菌落可以給出原表面微生物的存活狀況的鏡像“圖”。
使用拭子更為簡單和靈活，用拭子擦拭某個表面，它抹去的微生物數量就可以計算出了。對接觸裝置觸及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面，用拭子采樣特別方便。棉拭子的操作方法如下：
準備材料：自制無菌棉拭子或購買商品化的無菌棉拭子、內徑10cm×10cm無菌規格板、無菌生理鹽水、培養基平皿。
如果取樣物體是平面的，將無菌規格板放在物體表面，用浸濕的無菌棉拭子在無菌規格板空心處橫豎涂抹均勻，涂抹時隨之轉動棉拭子，剪去棉拭子與手接觸部分，將棉拭子放入裝有一定體積的無菌生理鹽水中待檢。
將采樣管敲打80次以上是棉拭子上的細菌充分擴散，做適當稀釋，進行平板計數，37℃培養48h計數。
細菌總數（CFU/cm2）=（平皿上菌落平均數×稀釋倍數）/采樣面積（cm2）

四、人員接觸面無菌檢查
人員與檢測對象的接觸面主要是受。
被檢人員洗手消毒后，五指并攏。將浸泡過的棉拭子沿雙手指屈從指根到指端往返涂擦兩次，涂擦的同時轉動棉拭子。剪去操作者手接觸部位，將棉拭子放入裝有一定體積的無菌室生理鹽水中待檢。
按“無菌室物體表面細菌污染檢查”的方法進行樣品處理、接種、培養、計數和報告結果。